Comme vous le savez, pour mesurer la viabilité cellulaire, de multiples techniques sont disponibles. Afin d'avoir une vision globale, cet article vous propose une revue des méthodes les plus fréquemment utilisées. Pour chacune d'entre elles, nous vous éclairons sur leur procédure, leurs avantages et inconvénients

 Quelles sont les méthodes couramment utilisées pour mesurer la viabilité cellulaire ?

    Pour des analyses haut débit, l’une des méthodes les plus fréquemment utilisée est la mesure de l’ATP intracellulaire. Cette mesure peut être faite grâce à des tests bioluminescents. En effet, la luciférase en présence de son substrat, la luciférine, et d’ATP, cofacteur de la réaction, produit de la lumière mesurable grâce à un luminomètre. La quantité de lumière émise est proportionnelle à la quantité d’ATP et donc au nombre de cellules vivantes. Cette technique très sensible est parfaitement adaptée à des tests en microplaques pour le haut et le très haut débit.

Beaucoup d’autres méthodes, plus anciennes, sont basées sur l’utilisation d’un réactif qui va être transformé, au cours d’une période incubation, en un produit coloré ou fluorescent par les cellules vivantes. L’absorbance ou la fluorescence de ce produit est ensuite mesurée à l’aide d’un lecteur. Le signal est proportionnel au nombre de cellules vivantes car les cellules mortes perdent leur capacité à transformer ce réactif. De nombreux tests de viabilité utilisent ce principe comme la réduction d’un composant de Tétrazolium (ex : MTT ou MTS) ou la mesure de l’activité des « live-cell proteases ». Ces essais sont néanmoins moins sensibles que les méthodes bioluminescentes et sont utilisables principalement pour des applications à plus faible débit. 

Comment suivre la viabilité cellulaire en temps réel ?

Promega a mis au point un test de viabilité en temps réel (voir fig. ci-dessous) qui utilise une nouvelle luciférase et un pro-substrat. Ces réactifs sont rajoutés directement dans le milieu de culture cellulaire. Le pro-substrat qui pénètre dans les cellules, est transformé par réduction en un substrat utilisable par la luciférase uniquement dans les cellules métaboliquement actives. Quand ce substrat actif ressort de la cellule il agit avec la luciférase pour produire un signal lumineux. Il est possible de réaliser des mesures sur un même essai pendant 3 jours et ainsi faire des cinétiques pour déterminer la dose-réponse à une drogue par exemple. Cette approche nécessite très peu de cellules, réduit le nombre de plaques et les cellules n’étant pas lysées, d’autres essais cellulaires ou d’autres applications peuvent être successivement réalisés.

Promega product: RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay (Cat.# G9711)

Comment fonctionnent les tests basés sur la mesure d’ATP ?

Seules les cellules vivantes sont capables de synthétiser de l’ATP. Il est possible de mesurer cette quantité d’ATP par un test bioluminescent en rajoutant dans le milieu de culture un tampon de lyse, qui va libérer l’ATP intracellulaire, une luciférase stabilisée, et son substrat la luciférine. En présence d’ATP, la luciférase va utiliser la luciférine et produire de la lumière (voir fig. ci-dessous). Ce test d’ATPmétrie, réalisé en 12min, est rapide car il ne nécessite pas de longue période d’incubation. De plus, il est très sensible, présente une large gamme dynamique qui le rend utilisable pour le haut débit, et réduit les risques d’artefacts à l’inverse des autres techniques.

Promega products: CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Cat.# G7570), CellTiter-Glo® 2.0 Assay (Cat.# G9241)

 

Comment fonctionnent les tests basés sur les protéases marqueurs de viabilité ?

L’activité de certaines protéases disparait rapidement après la mort cellulaire et peut donc être utilisée comme marqueur de cellules vivantes. Cette méthode de mesure implique l’utilisation d’un substrat fluorogénique qui après avoir pénétré dans les cellules (GF-AFC) est clivé par ces protéases actives en produisant un signal fluorescent proportionnel au nombre de cellules vivantes. En comparaison des méthodes basées sur la réduction du tétrazolium (citée ci-après), ce test est plus rapide avec une période d’incubation réduite à 0,5-1H, et il est non lytique ce qui offre la possibilité de faire du multiplexing avec d’autres essais comme d’autres tests cellulaires bioluminescents.

Promega product: CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay (Cat.# G6080)

Comment fonctionnent les tests de viabilité basés sur la réduction du tétrazolium ?

Le principe de ces tests est de déterminer la viabilité cellulaire en fonction de la capacité des cellules à réduire un colorant tétrazolium par l'action de l'enzyme, l'oxydoréductase cellulaire NAD (P) H-dépendante, présente dans les cellules viables.

Les composés de tétrazolium utilisés se divisent en deux grandes catégories :

            1) les composés chargés positivement (comme le MTT) qui pénètrent facilement dans la cellule. Ce dernier est réduit et convertit en formazan, de couleur pourpre, uniquement dans les cellules vivantes ayant un métabolisme actif. La formation de ce produit coloré est donc un marqueur de viabilité cellulaire. Cependant les temps d’incubation sont longs (généralement 4 H) et le formazan étant insoluble, il est nécessaire de rajouter un solubilisant avant d’effectuer la mesure par colorimétrie.

            2) les composés chargés négativement (MTS, XTT, WST-1) qui à l’inverse ne pénètrent pas dans les cellules. Il est donc nécessaire de coupler ces molécules à un accepteur d’électrons intermédiaire (PMS), capable de pénétrer les cellules et de transférer des électrons du NADH au tétrazolium qui sera alors réduit en formazan, forme soluble. Par conséquent le protocole est plus direct et plus pratique que celui avec le MTT. Le temps d’incubation de cette méthode reste identique, de 1 à 4H.

Promega products: CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Cat.# G4000), CellTiter 96® AQueous One solution Cell Proliferation (Cat. #G3582)

 

Comment fonctionnent les tests de viabilité basés sur la réduction de la résazurine ?

La résazurine est une autre molécule qui sert d’indicateur d’oxydo-réduction. Celle-ci a une couleur bleue nuit et présente une faible fluorescence intrinsèque. Après avoir pénétrée dans la cellule, en réponse à l’activité métabolique des cellules vivantes, la résazurine est réduite en résorufine qui elle à une couleur rose et est fluorescente. Après une période d’incubation de 1 à 4H la résorufine est mesurée par colorimétrie ou fluorimétrie. Cette méthode peu couteuse, est plus sensible que celle basée sur la réduction du tétrazolium mais de nombreux composés peuvent interagir et perturber la lecture.

Promega product: CellTiter-Blue® Cell Viability Assay (Cat.# G8080)

 

L’inconvénient majeur de ces essais basés sur la réduction du tétrazolium ou de la résazurine est qu’ils résultent de l’accumulation d’un produit coloré ou fluorescent. Comme le signal augmente graduellement au fil du temps, il est impossible de détecter une diminution de la viabilité cellulaire pendant cette longue incubation.