Pourquoi l'étape de digestion est si importante en Spectrométrie de Masse ?
L’essor de la Spectrométrie de Masse
Publié par Dr Mourad Ferhat, spécialiste analyse cellulaire et protéomique (Promega )
Les approches protéomiques sont devenues des outils incontournables de la biologie moderne. La spectrométrie de masse qui a permis l’accès à la première carte du protéome humain constitue l’une de ces méthodes en plein essor (1). Les diverses applications offertes par la spectrométrie de masse couvrent des domaines aussi variés que : la quantification de biomarqueurs, l’identification de micro-organismes ou encore l’étude fine des structures cellulaires (2).
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Préparer ses échantillons : une étape critique
L’approche dite « bottum-up » est la plus utilisée à l’heure actuelle pour l’identification des protéines dans les laboratoires de spectrométrie de masse : les protéines sont d’abord digérées pour obtenir un mélange de peptides qui sont ensuite séparés (étape de fractionnement) avant d’être analysés par spectrométrie de masse. L’étape de digestion est une étape essentielle de la phase de préparation des échantillons. Une digestion incomplète peut impacter la qualité des résultats obtenus et donc avoir des conséquences sur l’identification ou la quantification des protéines analysées.
Avec la trypsine par exemple, on observe 22% de sites non clivés dont la majorité (18%) concerne des résidus lysines (3). Le simple fait de combiner la trypsine à la protéase Lys-C (protéase spécifique clivant au niveau des résidus lysine) permet de réduire considérablement la proportion de sites perdus manière significative le nombre de sites perdus (6% de sites non clivés résiduels avec un mélange Trypsine/Lys-C, Figure 1). Cette meilleure digestion a des répercussions en termes de protéines identifiées (Tableau 1). Le mélange Trypsine/Lys-C permet également une digestion plus efficace en présence d’inhibiteurs de protéases présents dans l’échantillon ou présents les réactifs utilisés pour la préparation de l’extrait protéique.
Figure 1. Pourcentage de sites non clivés sur un extrait protéique de levure digéré avec la Trypsine seule ou le mélange Trypsine/Lys-C (Trypsin/Lys-C Mix, Promega)
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Echantillon |
Protéase |
Protéines identifiées |
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Tissus FFPE |
Trypsin |
165 |
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Trypsin/Lys-C |
182 (+ 10.3%) |
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Extrait protéique de cellules HeLa |
Trypsin |
3,760 |
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Trypsin/Lys-C |
4,108 (+ 9.3% ) |
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Extrait protéique de levure |
Trypsin |
1,252 |
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Trypsin/Lys-C |
1,495 (+ 19.4%) |
Tableau 1. Protéines identifiées après digestion de différents échantillons (tissus FFPE, extrait protéique de cellules Hela, extrait protéique de levure) après digestion avec la trypsine ou le mélange Trypsine/LysC (Trypsin/LysC-Mix, Promega).
Améliorer et accélérer l’étape de digestion
Plusieurs méthodes permettent d’améliorer l’étape de digestion. Au-delà du mélange Trypsin/Lys-C, Promega propose différentes versions de trypsine améliorées comme par exemple la Trypsine Gold hautement purifiée et présentant une plus forte efficacité protéolytique. Les améliorations concernent également la vitesse de digestion avec le récent lancement par Promega d’une trypsine à digestion rapide (Rapid Trypsin; Rapid Trypsin/Lys-C mix) permettant une digestion performante en seulement 60 min avec élimination des étapes de dénaturation et d’alkylation. Enfin des protéases dites « alternatives » peuvent également être utilisées ou combinées à la trypsine pour améliorer la digestion (4). Ces protéases alternatives démontrent un intérêt dans certains cas (5) comme pour la digestion des protéines membranaires ou difficiles à dénaturer (Tableau 2)
Tableau 2. Intérêt des protéases alternatives pour la digestion des protéines complexes.
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