C'est toujours un moment passionnant quand on trouve un nouveau test pour répondre à une question de recherche importante. Cependant il est nécessaire de confirmer que ce test fonctionnera bien dans vos conditions expérimentales. Réaliser le contrôle indiqué dans le manuel technique du kit est un excellent moyen d’évaluer sa performance.

Après avoir effectué le premier test, les résultats semblent plutôt bons. Les courbes des résultats avec et sans traitement sont cohérentes. Il est temps de passer aux expériences sur vos échantillons... mais attendez – les valeurs mesurées (en RLU - Relative Light Unit) sont très inférieures à celles du protocole ! Cela ne correspond pas. Qu'est-ce que j'ai mal fait ?

C'est une question que nous traitons fréquemment au sein du service technique. L'inquiétude est réelle, et j'ai eu personnellement la même interrogation lors de mes premières expérimentations utilisant la luminescence. Lorsqu’on nous pose ce type de question, nous nous assurons d’abord que l'expérience a bien été réalisée dans les conditions décrites dans le protocole. Et c'est le cas la plupart du temps.
Alors nous commençons à expliquer ce que sont les RLU (Relative Light Unit).

 

Qu'est-ce qu'une valeur relative ?

Vous avez probablement entendu parler de RLU ou RFU (Relative Fluorescent Unit) durant votre cursus au laboratoire. Mais si comme moi, vous ne saviez pas vraiment ce que c'était, vous avez probablement supposé qu’il s’agît d’unités de mesure avec une valeur standard bien définie. En fait, ce n'est pas le cas pour les RLU et les RFU - elles ne sont pas standardisées. Pour cette raison, elles ne peuvent pas être comparées entre elles lorsqu’elles ont été obtenues avec des instruments différents.

Lorsque vous mesurez le signal luminescents ou fluorescent, vous mesurez le nombre de photons émis. Mais Il s'avère qu'il est difficile de les quantifier précisément. Nos Lecteurs GloMax®, ainsi que la plupart des luminomètres de haute qualité, contiennent un tube photomultiplicateur (PMT) qui amplifie ce signal afin qu'il puisse être mesuré. Très simplement, lorsque les photons viennent frapper la fenêtre de détection, des électrons sont produits et génèrent un signal électrique qui est ensuite lui-même amplifié. Plus il y a de photons, plus le signal électrique est important. Le logiciel de l'instrument tente alors de quantifier ce signal électrique en le rapportant en une valeur numérique.

Comme vous pouvez l'imaginer, il existe différentes méthodes pour convertir le signal électrique en valeurs numériques. Comme ces valeurs sont calculées proportionnellement au signal électrique, elles sont relatives à la quantité de signal électrique produite : d’où le terme « relatif » dans RLU.

Certains instruments peuvent utiliser une échelle de 0 à 10 000 000 000, tandis que d'autres utilisent des valeurs de 0,1 à 10 000.  De plus, comme le PMT repose sur la production d'électrons en réponse à un photon et que le signal électrique produit est ensuite amplifié, deux appareils différents du même modèle peuvent donner des valeurs RLU différentes pour le même échantillon. Par conséquent, il ne faut jamais comparer des RLU brutes.

 

Mais si tout est relatif, comment puis-je évaluer mes résultats ?

Comment savoir si mon test a fonctionné ? La meilleure façon de le savoir est de réaliser le contrôle décrit dans le manuel technique : comprenant tous les contrôles positifs, négatifs, bruit de fond ainsi que tout autre contrôle qui pourrait être recommandé.

Les valeurs brutes de RLUs dues au bruit de fond (mesurées avec le milieu ou le tampon seul) doivent être soustraites de toutes les valeurs de vos échantillons pour une meilleur précision. Cette soustraction permet d’obtenir la valeur réelle du contrôle positif. Les valeurs RLU peuvent ensuite être normalisées par rapport au contrôle négatif (échantillon non traité, mesuré sur la même plaque). Cette valeur normalisée est sans unité et peut donc être maintenant utilisée pour faire des comparaisons. Si vous avez un test robuste, ce taux de variation doit être comparable entre les différentes plaques, expériences, expérimentateurs et instruments. Pour les tests effet-dose, vous pouvez également calculer et comparer les EC50/IC50. En ce qui concerne les tests de gènes rapporteurs utilisant des transfections transitoires, nous recommandons également de transfecter un second vecteur, de contrôle interne, avec un autre gène rapporteur pour normaliser l'efficacité de la transfection ou d'autres sources de variabilité.

Si vous débutez une nouvelle étude pour laquelle il n’existe pas de traitement et ni de réponse connus, vous pouvez réaliser une courbe d’étalonnage et utiliser les valeurs RLU brutes obtenues pour déterminer la concentration de l'analyte dans les échantillons étudiés. S'il s'agit d'un essai cellulaire, vous pouvez aussi quantifier le nombre de cellules. Vous obtenez ainsi grâce à ces tests contrôles une gamme de RLU qui permettent de déterminer la sensibilité, la gamme dynamique et d'optimiser vos conditions expérimentales.

Les tests luminescents offrent une meilleure sensibilité, un faible bruit de fond ainsi qu’une grande gamme dynamique. Mais n’oubliez pas que vous obtenez des valeurs relatives qu’il est nécessaire de normaliser par rapport à un contrôle pour pouvoir faire de études comparatives.

Ci-dessous quelques outils et exemples pour analyser quelques essais cellulaires ou gènes rapporteurs

ApoTox-Glo™ Triplex Assay Data Analysis Worksheet

En utilisant les données d'entrée des essais de viabilité, de cytotoxicité et d'apoptose, la feuille de calcul soustrait le bruit de fond, calcule les moyennes et les écarts types des réplicas et calcule le taux de variation des cellules non traitées (UTC). Cette feuille de calcul peut être utilisée pour d'autres données de tests viabilité cellulaire si vous suivez la même disposition de la plaque.

Designing a Bioluminescent Reporter Assay: Normalization Options