Qu'est-ce qui fait un «bon» tampon ?
La définition la plus simple d'un tampon est une solution qui maintient un ppH stable malgré certains facteurs internes et environnementaux. Son efficacité dépend de son pKa, qui est la constante de dissociation acide. De nombreux facteurs, tels que les changements de température ou de concentration, peuvent affecter le pKa d'un tampon.
En 1966, Norman Good et ses collaborateurs ont entrepris de définir quels étaient les meilleurs tampons pour les systèmes biochimiques (1). En 1980, ils ont identifié vingt tampons qui sont devenus la norme pour les systèmes biologiques et biochimiques (2,3). Pour sélectionner ces tampons, Good a établi plusieurs critères :
1. Un pKa compris entre 6 et 8. En effet la plupart des réactions biochimiques et biologiques sont optimales à un pH compris entre 6 et 8. La plage optimale d’utilisation d'un tampon est à plus ou moins 1 unité de pH autour de sa constante de dissociation acide (Pka) .
2. La solubilité dans l'eau. Les réactions biologiques, pour la plupart, se produisent dans des environnements aqueux et pour cette raison le tampon doit être soluble dans l'eau.
3. l’exclusion par les membranes biologiques. Cela n'intervient pas dans toutes les réactions biochimiques. Cependant, cela peut être un critère important pour certaines expériences , et il est alors utile de se rappeler que les tampons zwitterioniques (charges opposées sur des atomes non adjacents) ne passent pas les membranes biologiques. Les tampons MOPS et les HEPES sont des exemples de tampons zwitterioniques contrairement aux tampons Tris et phosphates qui ne s'isomérisent pas en zwitterions.
4. les Effets de sels. En d'autres termes, les composants des tampons ne doivent pas interagir ou affecter les ions impliqués dans les réactions biochimiques étudiées.
5. Les effets des changements de température et de concentration sur la pKa. En général, un changement de concentration entraîne une modification de la pKa. Si ce changement est faible, les solutions mères peuvent être diluées sans modifier le pH du tampon. Cependant, avec certains tampons, la modification de la concentration produit des changements plus spectaculaires de la pKa, et les solutions mères ne peuvent alors pas être diluées sans affecter significativement le pH.
Par exemple, le pH du tampon Tris diminue d'environ 0,1 unité de pH pour chaque dilution au dixième. Son pH pourrait donc changer de façon spectaculaire si vous le diluez et ainsi vous retrouvez aux limites de ses conditions d’utilisation (son effet tampon est optimal entre un pH 7,3-9,3 à 20°C). Notez que le Tris n'est pas un des tampons de Good.
Les changements de température peuvent également être un problème, et là encore, le tampon Tris couramment utilisé est un bon exemple. En effet il présente de grande variation de pKa avec les changements de température. Par exemple, si vous préparez un tampon Tris à un pH 7,0 dans une chambre froide à 4,0°C, et que vous faite la réaction dans ce même tampon mais à 37°C, le pH tombera à 5,95.
Si vous avez un tampon Tris qui a été préparé à 20°C avec un pKa de 8,3, cela sera un tampon efficace pour de nombreuses réactions biochimiques pour des compris entre 7,3-9,3. Mais le même tampon Tris utilisé à 4°C devient un mauvais tampon à pH 7,3 car à cette température son pKa passe à 8,8.
Le message que vous devez retenir est le suivant : Fabriquez un tampon à la température que vous prévoyez de l’utiliser. Si votre expérience implique un changement de température, choisissez un tampon dont la plage d’utilisation peut s'adapter à des changements de pKa dus à des changements des température.
6. Interactions bien définies ou inexistantes avec les cations des minéraux. Si le tampon et les cations présents dans votre système réactionnel interagissent alors votre tampon devient moins efficace car il ne peut plus gérer l’apport d’ions hydrogène supplémentaires. Si un complexe se forme entre le tampon et un cofacteur requis, par exemple un cation métallique comme le zinc ou le magnésium, votre réaction pourrait également être compromise.
Par exemple, la présence d’une quantité excessive d'un agent chélatant dans une réaction enzymatique peut poser des problèmes (comme une concentration trop élevée d'EDTA dans une amplification PCR, par exemple).
Dans ce cadre les tampons Tris peuvent à nouveau poser des problèmes. En effet le tampon Tris contient un groupe amine réactif. Si vous fabriquez un tampon Tris Rnase free, le groupe amine de la molécule Tris réagira avec le diethylpyrocarbonate (DEPC). Or c’est un produit couramment utilisé pour prétraiter les solutions aqueuses qui vont être utilisées pour travailler avec de l’ARN. Il ne faut donc pas traiter les solutions contenant du Tris avec du DEPC. Notez que l'HEPES réagit également avec le DEPC. (le MOPS est un bien meilleur tampon pour la plupart des travaux sur l'ARN).
Message à retenir : Les tampons ne sont pas inertes. Soyez prudent dans le choix de celui-ci.
7. Stabilité chimique. Le tampon doit être stable et ne pas se décomposer dans les conditions de travail. Il ne doit pas s'oxyder ni être affecté par le système dans lequel il est utilisé. Essayez d'éviter les tampons qui contiennent des composés qui interviennent dans les réactions (par exemple, des métabolites).
8. Absorption de la lumière. Le tampon ne doit pas absorber la lumière UV à des longueurs d'onde qui peuvent être utilisées pour des lectures dans des expériences photométriques.
9. Facilité d'utilisation. Les composants du tampon doivent être faciles à trouver et à préparer.
References:
Good, N.E., et al. (1966) Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochemistry. 5(2): 467–77.
Good, N.E. and Izawa, S. (1972) Hydrogen Ion Buffers. Methods Enzymol. 24: 53–68.
Ferguson, W.J., et al. (1980) Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Anal. Biochem. 104(2): 300–10.
