Les produits de PCR générés par une ADN polymérase ayant une activité proofreading (telle que la Pfu DNA polymérase) donc générant des bouts francs peuvent-ils être utilisés pour faire du TA cloning ?
OUI ! Il vous suffira de faire un A tailing auparavant avec le protocole suivant
1. Prendre 1-7μl du fragment PCR purifié. Remarque: Le fragment doit être purifié ou l'enzyme proofreading continuera à supprimer les A créés par la Taq DNA Polymérase.
2. Ajoutez 2 µl de tampon Gotaq réaction Buffer 5X (ou 1 µl de tampon 10X) contenant 1,5 mM de MgCl2
3. Ajouter du dATP à une concentration finale de 0,2 mM.
4. Ajoutez 5 unités de GoTaq Flexi DNA Polymérase.
5 .Ajouter de l’eau nucléase free qsp 10µl
6. Incuber à 70 ° C pendant 15-30 minutes.
7. Utilisez 1-2μl pour la ligation Les produits de PCR ainsi traités peuvent donc être directement clonés par simple ligation dans des vecteurs comme le pGEM®-T Vector (Cat. # A3600)
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