Comment choisir sa Reverse Transcriptase
Les deux RT les plus utilisée sont l’AMV (avian myeloblastosis virus) et la MMLV (Moloney murine leukemia virus).
L’AMV (avian myeloblastosis virus)
La température d’activité maximale de l’AMV est située entre 42 et 48°C mais il est possible de travailler entre 25 et 58°C. L’intérêt de travailler à une température plus élevée est de pouvoir dénaturer les régions secondaires fortes ou riches en GC. L’AMV est compatible, comme toutes les RT, avec des primers spécifiques aux gènes, des oligoDT ou encore des random primers. Toutefois l’utilisation de randoms hexamères nécessite une température réactionnelle réduite à 37°C.
Réaliser des essais à une température élevée résout le problème des structures secondaires mais au détriment de l’intégrité de l’ARN. L’ARN étant thermolabile il est sensible à la dégradation. Normalement l’hydrolyse de l’ARN est faible mais celle-ci peut augmenter selon le pH, une température élevée et la présence de cations divalents. Pour réaliser la synthèse d'ADNc à partir d’ARN longs il est recommandé de ne pas travailler à des températures trop élevées. Pour réduire au maximum le temps d’exposition de l’ARN à de hautes températures, il est conseillé d’incorporer une étape initiale de dénaturation où l'ARN et l'amorce RT sont combinés, brièvement chauffés pour aider à dénaturer toutes structures secondaires puis rapidement refroidis dans de la glace pour conserver l'état dénaturé. La RT, le tampon de réaction et les dNTPs sont ensuite ajoutés et la réaction est incubée à la température souhaitée.
L’AMV possède une activité intrinsèque RNase-H qui dégrade le brin d’ARN de l’hybride ARN/ADN et qui peut couper l’ARN si l’enzyme s’arrête durant la synthèse. Cela réduit le rendement total de d’ADNc obtenus ainsi que le pourcentage de ADNc entier, limitant ainsi l’utilité de l’AMV pour la transcription inverse des ARN de plus de 5kb.
L’AMV étant plus processive que la MMLV elle nécessite moins d’unités pour générer la même quantité d'ADNc : 25 unités d'AMV RT équivalent à environ 200 unités de M-MLV RT. Ces enzymes, inhibitrices de la Taq polymérase devront être inactivées avant l’étape de PCR par un chauffage à 70 ou 100°C suivi de 5 min dans la glace.
L’AMV est donc recommandée pour de la RT PCR en 1 ou 2 étapes, pour la reverse transcription d’ARN <5kb et l’extension d’amorces, en particulier si l’ARN a une forte structure secondaire.
La MMLV (Moloney murine leukemia virus).
La MMLV est souvent utilisée pour la transcription inverse d’ARN >5kb en raison de son activité RNase H plus faible. Toutefois sa température optimale d’activité plus basse, autour de 37°, la rend moins efficace en cas de structures secondaires fortes. Il existe cependant des variations de la RT de type sauvage M-MLV qui sont populaires en raison de l’absence de l'activité de la RNase H et des températures de réaction plus élevées. La variante la plus populaire est le mutant M-MLV RT RNase H-point mutant, qui peut être utilisé à des températures allant jusqu'à 55°C, rendant le mutant M-MLV RT RNase H- point approprié pour les ARN avec de fortes structures secondaires.
En revanche, en l’absence de structures secondaires, travailler à des températures plus faibles permet d’avoir des ADNc plus longs.
Ainsi l'absence d'activité de la RNase H fait du mutant M-MLV RT RNase H- point mutant l'enzyme de choix pour la transcription inverse d'ARN longs pour la construction de bibliothèques d'ADNc, la génération de sondes d'ADNc et l'extension d’amorces.
En conclusion, pour choisir la bonne enzyme pour votre projet de synthèse d'ADNc et de RT-PCR, voici quelques questions à vous poser afin de vous guider vers l’enzyme la mieux adaptée à votre application :
- Travaillez-vous avec un modèle qui présente des structures secondaires élevées ?
L’AMV est la transcriptase inverse de choix pour les modèles ayant une structure secondaire élevée, en raison de sa stabilité à des températures réactionnelles plus élevées (37-58°C).
- Réalisez-vous de la RT-PCR en routine et de ce fait recherchez-vous une RT qui soit économique ?
La MMLV-H Minus (M-MLV RT[H-]), Point Mutant, est une réverse transcriptase qui peut être utilisée dans la synthèse d'ADNc lors d’une RT-PCR et qui fonctionne très bien avec des transcrits longs.
- Allez-vous effectuer de la RT-qPCR, travailler sur des cibles rares ou très longues, ou disposer d’un ARN qui pourrait contenir des contaminants inhibiteurs de PCR ?
Dans ce cas, faites le choix de la GoScript™ Reverse Transcriptase. Elle utilise une RT M-MLV et des tampons spécifiquement conçus pour la RT-qPCR afin de fournir une synthèse d'ADNc robuste et fiable, même en présence d'inhibiteurs.
Consultez le sélecteur de transcriptase inverse pour plus d'informations.
