Qu'est-ce qu'un test immunologique ?

Un test immunologique ou immunoessai est une méthode qui mesure la présence ou la quantité d'analytes dans un échantillon biologique grâce à l’utilisation d’un anticorps spécifique. Il peut être adapté pour détecter des protéines, des lipides, des acides nucléiques ou de petites molécules cibles, du moment qu’il existe un anticorps capable de se fixer spécifiquement sur la cible étudiée.

Cette technique, très fiable et reproductible, est couramment utilisée dans la recherche scientifique fondamentale comme dans le diagnostic clinique.

Comment fonctionnent les immunoessais ?

Il en existe plusieurs formats, mais tous impliquent au minimum ces trois principaux éléments :

1. L'analyte cible : l'antigène qui est détecté dans l’échantillon
2. L’anticorps : la protéine en forme de Y qui se lie spécifiquement à l'analyte cible
3. Le marqueur de détection du complexe antigène/anticorps : couplé à l’un des 2 éléments, il génère un signal mesurable le plus souvent par colorimétrie, fluorescence ou luminescence.

Lorsque les analytes cibles et les anticorps sont mis en présence dans une solution, ils ont la capacité de se reconnaitre et de se lier spécifiquement comme une serrure et une clé. Après avoir éliminé par lavages les anticorps non fixés, le signal généré par le marqueur de détection mesure la quantité de complexes antigène-anticorps formés.

Les protocoles d’immunoessais traditionnels sont plutôt longs, fastidieux, comprenant plusieurs étapes de lavage. Cependant, l'avancée des nouvelles technologies a permis de mettre au point des immunodosages, tels que les essais Lumit™, plus rapides et sans aucune étape de lavage.

 

Les différentes méthodes d'immunoessais

• Les tests immuno-enzymatiques (ELISA)

Dans les tests ELISA, l'antigène recherché ou l’anticorps spécifique est immobilisé sur une surface solide (le plus souvent celle d’un puit d’une microplaque). Il existe aussi plusieurs formats de tests ELISA mais ils comportent tous au minimum les étapes suivantes :

1. Le coating : fixation d'un antigène/anticorps spécifique sur une surface solide.
2. L’incubation : liaison de l'antigène et de l'anticorps primaire spécifique.
3. Le(s) Lavage(s) : élimination de l'antigène et de l'anticorps libres non liés.
4. La détection : mesure du signal généré par une enzyme en réponse à la formation du complexe antigène/anticorps.

On distingue quatre catégories principales de tests ELISA qui diffèrent par la manière dont l'antigène/anticorps est déposé sur la plaque et selon l'endroit où se trouve fixé l’enzyme générateur du signal à mesurer. Et pour chaque type d'ELISA, ce signal de détection peut être soit colorimétrique, fluorométrique ou encore chimioluminescent.

 

Test ELISA direct

Dans le cadre d’un test ELISA direct, l’enzyme de détection est conjuguée sur l’anticorps lui-même. Celui-ci sera incubé sur avec l'antigène préalablement fixé à la surface de la plaque. Le signal est ainsi généré directement au niveau de l'anticorps primaire.

Les avantages de ce format : test simple et rapide avec un nombre limité d’étapes

Les limites de ce format: moins spécifique (la réactivité de l’anticorps peut être diminuée par la présence de l’enzyme fixée) ; sensibilité limitée car le signal ne peut pas être amplifié.

 

Test ELISA indirect

Le test ELISA indirect est une méthode avec deux étapes d’incubation. Pour commencer, l'antigène est incubé avec l’anticorps primaire spécifique. Puis est ajouté un second anticorps, conjugué avec l’enzyme de détection, qui vient reconnaitre et se fixer sur l'anticorps primaire. Contrairement au test Elisa direct, le signal est généré au niveau de l’anticorps secondaire.

Les avantages de ce format : sensibilité plus élevée car permet l'amplification du signal, plus flexible (il existe plus d’anticorps secondaires marqués disponibles contre peu d’anticorps primaires)

Les limites de ce format : flux de travail plus complexe (plus d'étapes) ; possibilité de réactions croisées de l'anticorps secondaire pouvant entrainer de forts signaux de bruit de fond.

 

Test ELISA sandwich

Le test ELISA sandwich nécessite deux anticorps primaires dirigés contre différents épitopes de l'antigène cible. L'un des anticorps primaires (dit de capture) est immobilisé à la surface d’une plaque et fixe l'antigène cible. Puis, un deuxième anticorps primaire vient également se lier à l'antigène cible, formant alors un complexe dit en « sandwich ». Le signal enzymatique est généré par le second anticorps primaire.

Les tests ELISA sandwich sont particulièrement utiles lorsque la concentration en antigènes est faible ou s’ils sont en présence d’une forte concentration de protéines contaminantes.

Les avantages de ce format : plus spécifique (car 2 anticorps), sensible et de flexible (les 2 méthodes de détection directe et indirecte sont possibles). Convient aux échantillons complexes.

Les limites de ce format : beaucoup plus d’étapes, difficulté de trouver des couples d'anticorps appropriés, nécessite d’avantages d’optimisation (réactivité croisée entre les anticorps)

 

Test ELISA compétitif

Le concept de ce test ELISA est basé sur la liaison compétitive entre l’antigène de l'échantillon et un antigène de référence pour se fixer à l’anticorps (celui-ci reconnaissant le même site de liaison sur les 2 antigènes).

Généralement un antigène de référence est fixé sur la surface des puits d’une microplaque. Puis est ajouté dans les puits l’échantillon et l’anticorps. Les antigènes présents dans l'échantillon entrent alors en compétition avec les antigènes de référence (fixés dans le puit) pour se lier à l'anticorps. Plus la concentration en antigènes dans l'échantillon est élevée, moins il y aura d'anticorps liés à l'antigène de référence, et plus le signal de détection sera faible.

Tous les tests ELISA présentés ci-dessus peuvent être adaptés à un format compétitif.

Les avantages de ce format : flexibilité, robustesse (minimise les effets de la dilution de l'échantillon et de la matrice), pouvant être utilisé avec échantillon brut (aucune purification de l'antigène n'est nécessaire).

Les limites de ce format : plutôt long et complexe

 

• Les dosages radio-immunologique (RIA)

Les dosages radio-immunologiques utilisent des isotopes radioactifs comme marqueur de détection. Ces tests sont basés sur la liaison compétitive. Tout d'abord, l’antigène cible sur lequel un élément radioactif (appelé "traceur") a été fixé, est mélangé à un anticorps spécifique pour former des complexes antigène-anticorps. Ensuite, un échantillon contenant l’antigène à quantifié (non marqué) est ajouté au mélange. Ce dernier entre en compétition avec les antigènes marqués pour les mêmes sites de liaison des anticorps. Cette compétition libère alors une certaine quantité d’antigènes marqués ("traceur libre"). La concentration en antigènes dans l'échantillon sera déterminée par le ratio des signaux radioactifs émis par les traceurs libres et par les traceurs liés à l'anticorps : plus la concentration en antigènes dans l’échantillon est élevée, plus le signal des traceurs fixés est bas !

Les avantages de cet essai : sensibilité élevée

Les limites de cet essai : les risques liés à l’exposition aux radiations ; l’élimination des déchets radioactifs.

 

• imuno-essais basés sur le FRET

Ces immunodosages sont basés sur le transfert d'énergie entre 2 molécules fluorescentes (un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur). Les fluorophores sont conjugués à des anticorps qui, lorsqu'ils sont liés à l'analyte cible, se retrouvent à proximité. Le fluorophore donneur, alors excité par une source d'énergie telle qu'une lampe ou un laser (ce qui nécessite une instrumentation spécialisée), peut transférer une partie de son énergie au fluorophore accepteur. Les émissions fluorescences du donneur et l'accepteur sont toutes deux mesurées, et les résultats sont générés sous la forme d'un rapport entre les deux signaux. Les variantes des immunessais basés sur le FRET sont la fluorescence en temps résolu (TR-FRET) et la HTRF® (Homogenous Time-Resolved Fluorescence) qui utilisent une autre molécule donneuse pour réduire le signal de fond et augmenter la stabilité du signal.

Les avantages de ce test : test homogène, extensible au format 384 puits.

Les limites de ce test : Nécessite d’être équiper d’instruments spécialisés ; doit être réalisé dans un environnement à faible luminosité.

 

 

• L’Immunoessais Lumit™

Les tests immunologiques Lumit™ sont basés sur la technologie NanoBiT®, système qui repose sur la complémentation entre deux sous-unités d'une enzyme luciférase modifiée : small bit (SmBiT) et large bit (LgBiT). Ces deux sous-unités ont une faible affinité l'une pour l'autre et ne peuvent former une luciférase NanoLuc® active que lorsqu'elles sont à proximité immédiate. Pour détecter un antigène spécifique, des anticorps sont marqués avec LgBiT et SmBiT et mélangés à l'échantillon. Lorsque les anticorps se lient à l'antigène, le LgBiT et le SmBiT sont rapprochés pour former la luciférase NanoLuc® fonctionnelle. Un réactif de détection contenant un substrat est ajouté pour générer un signal luminescent proportionnel aux niveaux d'antigène cible. Les immunodosages Lumit™ peuvent être réalisés en 1 heure, sans étape de lavage, dans un seul puit - ce qui les rendent compatibles pour les applications à haut débit.

Les avantages de cet essai : rapide ; aucune étape de lavage ; sensibilité élevée ; large gamme dynamique ; ne nécessite pas de plaques pré-enduites ni d'instruments spécialisés.

Les limites de cet essai : tous les tests ne sont pas compatibles avec les échantillons de sérum.

 

Choisir un essai immunologique

Choisir, parmi toutes les options disponibles, l’immunoessai adapté à votre projet, nécessite de prendre en considération plusieurs éléments.

• Quels sont les instruments auxquels vous avez accès ?

  De nombreux kits d'immunoessais nécessitent, pour la détection et le lavage des plaques, des instruments spécialisés relativement couteux. Cette approche peut être un frein pour les laboratoires qui ne peuvent y avoir accès et disposant d'un budget limité. Dans ce cas, orientez-vous de préférence vers des tests qui ne nécessitent qu’un lecteur de plaques standard pour la mesure du signal par fluorescence ou luminescence, instrument plus courant et plus abordable.

   

• Combien d'échantillons avez-vous à traiter ?

  Si vous traitez régulièrement des centaines ou des milliers d'échantillons, il est important de trouver un format qui puisse s'adapter à votre débit. Certains tests sont limités aux formats 96 puits, tandis que d'autres sont compatibles avec des plaques allant jusqu’à 1 536 puits.

   

• Quel est type d'échantillon analysez-vous ?

  Pour les échantillons classiques issus de cultures cellulaires, vous pouvez opter pour la plupart des formats d’immunoessais. En revanche, si vous analysez d'autres échantillons, comme du sang ou du sérum, il est important de vous assurer que le test choisi soit compatible.

   

• Dans quel délai voulez-vous obtenir les résultats ?

  Le temps nécessaire à la réalisation d'un test immunologique peut varier considérablement : de 1 heure à 2j lorsque selon le nombre de lavages et des durées d’incubation (pouvant nécessiter une nuit dans certains cas). Il peut s’avérer alors important d’évaluer le rapport entre le coût et le gain de temps !

   

• Quelle est le seuil de sensibilité attendu ?

La sensibilité d'un test immunologique est importante pour avoir la garantie de détecter la présence d'antigènes même à faibles concentrations. Pour obtenir des mesures précises sur des échantillons à faibles comme à fortes concentrations en antigènes, privilégiez les tests offrant une plus large gamme dynamique. Vous éviterez ainsi les étapes contraignantes de la dilution des échantillons en amont de la mesure.

 

Comparaison des essais les plus couramment utilisés

*compatibilité à vérifier selon le test.