De la séquence à la molécule : fabrication d'un ARNm thérapeutique

Contexte et objectifs

Les thérapies à base d’ARNm connaissent un essor considérable, notamment depuis le développement des vaccins anti-COVID-19. Elles couvrent aujourd'hui un large spectre d'applications : vaccins, thérapies protéiques de substitution et immunothérapies (2).

Avant d'envisager le processus de formulation pharmaceutique, il est primordial de s'assurer que l'ARN produit est de qualité suffisante : séquence d'intérêt correcte, caractéristiques physicochimiques et pureté adéquates pour garantir la fiabilité du composé lors des étapes ultérieures. Il est alors utile de distinguer la substance active de la forme pharmaceutique finie (6) :

Terme	Définition
Substance active (drug substance)	L'ingrédient actif destiné à produire un effet pharmacologique
Forme pharmaceutique finie (drug product)	La préparation finale prête à être administrée au patient

 

🎯 Ce document se concentre sur la production de la substance active, c'est-à-dire tout ce qui se passe en amont de la formulation.

 

Qu'est-ce qu'un ARNm thérapeutique de synthèse ?

Au départ, c’est une séquence d’ARN modifiée génétiquement en laboratoire conçu pour exprimer une protéine thérapeutique attendue.

L'objectif est ensuite de réussir à développer une substance active : soit une molécule d'ARNm reproductible, conforme à séquence ciblée et avec un niveau de qualité suffisant pour conditionner la suite du développement.

 

 

 

La transcription in vitro (IVT) : principe et mise en œuvre

1. Principe général

La transcription in vitro (IVT) est un procédé acellulaire permettant de synthétiser de l'ARNm à partir d'une matrice d'ADN. Elle repose sur trois composants essentiels :

Matrice d'ADN + rNTPs + ARN polymérase  →  ARNm

Les ARN polymérases les plus utilisées sont d'origine bactériophagique : T7, T3 ou SP6, selon le promoteur présent dans la matrice (3,4).

2. Conception de la matrice d'ADN

La matrice d'ADN doit être soigneusement élaborée pour permettre la synthèse d'un ARNm fonctionnel. Elle comprend plusieurs éléments essentiels :

5' ─[ Promoteur T7 ]─[ 5'UTR ]─[ Séquence d'intérêt ]─[ 3'UTR ]─[ Poly(A) ]─ 3'

• Promoteur (ex. T7) : signal de démarrage pour la polymérase
• UTR 5' et 3' (Untranslated Regions) : régions non codantes qui régulent la stabilité et la traduction
• Queue poly(A) : protège l'ARNm de la dégradation et favorise la traduction (4

 

Les étapes de production d'un ARNm

Étape 1 — Obtention de la matrice d'ADN

Trois formats de matrices sont couramment utilisés :

• Plasmide linéarisé : obtenu par digestion enzymatique d'un plasmide
• Produit PCR : amplifié avec une amorce portant le promoteur
• Oligonucléotides hybridés : surtout pour les ARN courts

⚠️ Le choix du format influence directement la qualité et la longueur de l'ARN produit.

Étape 2 — Mise en place de la réaction IVT

La plupart des protocoles de transcription in vitro (IVT) utilisent les mêmes catégories de composants (4,8,10) :

 

Composant	Rôle
ARN polymérase (ex. T7)	Synthèse de l'ARN
rNTPs	Substrats nucléotidiques
Inhibiteur de RNase	Protection de l'ARN contre la dégradation
Pyrophosphatase inorganique	Optimisation du rendement
Analogue de coiffe	Génération d'une extrémité 5' native (favorise la traduction)

 

Étape 3 — Ajustement des conditions réactionnelles

Selon l'application prévue, il est possible d’opter pour (5) :

• Un ARN coiffé ou non coiffé : la coiffe en 5' améliore la stabilité et l'efficacité de traduction (24)
• Des Nucléotides standard ou modifiés : les nucléotides modifiés (ex. pseudouridine) réduisent l'immunogénicité et augmentent la stabilité.

Ces décisions ont des répercussions directes sur deux aspects fondamentaux : d'une part, la performance thérapeutique de l'ARNm au sein des cellules cibles (efficacité de traduction, stabilité intracellulaire, immunogénicité) ; d'autre part, la stratégie analytique à mettre en place, certaines modifications pouvant interférer avec les techniques de caractérisation habituelles.

📌 À la suite de ces trois principales étapes, les procédures habituelles incluent également la suppression de la matrice, la purification et une évaluation qualitative de l'ARN avant la formulation. (5)

Sources de variabilité : points de vigilance

L'un des défis majeurs de la production d'ARNm par IVT est d'obtenir une préparation homogène et pure. En effet, la présence d'impuretés ou une hétérogénéité des transcrits peuvent entraîner un manque de reproductibilité expérimentale, une faible efficacité de traduction ou des résultats difficiles à interpréter.

De nombreuses variables influencent le rendement et la qualité de l'ARNm, mais certains problèmes récurrents tendent à apparaître dans la plupart des procédures, notamment les variables de fabrication, les compromis liés à la purification et la sensibilité au changement d'échelle.

1. Conception du transcrit

La variabilité trouve souvent son origine au niveau de la séquence et de la conception des transcrits.

• L'utilisation des codons (codon usage) et la teneur en GC influencent l'efficacité de transcription (4)
• Les éléments structuraux secondaires de l'ARN peuvent gêner la polymérase
• La conception des extrémités 5', 3' et le choix des UTR conditionnent les performances en traduction (2,4)

2. Optimisation de la réaction

La configuration de la réaction joue également un rôle déterminant : le choix de la polymérase, des nucléotides et des réactifs auxiliaires peut faire varier le rendement et la reproductibilité d'un run à l'autre (4). L'environnement réactionnel influençant à la fois l'intégrité du produit et la formation de sous-produits, l'optimisation de la réaction est généralement traitée comme partie intégrante du processus de fabrication, au même titre que la purification. (4)

 

3. Purification de l'ARNm

Après transcription, il est nécessaire d'éliminer les composants résiduels :

À éliminer	Pourquoi
ADN matrice résiduel	Interfère avec les analyses
Enzymes et nucléotides libres	Contamination de la préparation
ARN double brin (dsRNA)	Fortement immunogène, biaise les tests fonctionnels

 

La méthode de purification la plus répandue consiste à capturer l'ARNm sur colonne ou sur billes, puis à le laver avant de l'éluer dans un faible volume. (7)

⚖️ L'enjeu est de trouver le bon équilibre entre rendement et pureté.

 

4. Évolution de l'échelle réactionnelle

Des protocoles parfaitement au point en petit volume peuvent se révéler instables dès lors que le volume et le débit augmentent. Il est donc recommandé, dès les premières étapes du développement, de standardiser les composants, de documenter rigoureusement les conditions expérimentales afin que les résultats restent comparables à mesure que le volume et le débit changent. (5,10)

 

Pourquoi éviter les réactifs d'origine animale ?

Certains réactifs utilisés dans les réactions de Transciption in vitro peuvent être d'origine animale. Or, leur utilisation présente plusieurs inconvénients :

1. Ajouter une Variabilité supplémentaire : les matières d'origine animale peuvent introduire des impuretés difficilement contrôlables d'un lot à l'autre
2. Aloudir le contexte réglementaire : leur utilisation complexifie les dossiers réglementaires en raison de la traçabilité et des évaluations de risque liées aux agents TSE/BSE (encéphalopathies spongiformes transmissibles)

Il est donc recommandé de privilégier des réactifs d'origine non animale (AOF, Animal Origin-Free), produits selon les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF / cGMP). À mesure qu'un programme thérapeutique avance, ces exigences deviennent de plus en plus formelles. (8,10)

Conclusion

Dans de nombreux programmes de développement, les problèmes rencontrés en fin de processus ont souvent pour origine des erreurs commises dès les première étapes début de la conception.

Lorsque chaque étape est bien maîtrisée — conception de la matrice d'ADN, choix des réactifs, purification et contrôles qualité — il est beaucoup plus facile d'identifier les problèmes, d'augmenter les volumes de production et de s'assurer que les résultats restent comparables d'un lot à l'autre.

Il est également important de, permet éviter bien des surprises lors des étapes ultérieures. (4,5)

Enfin, même en phase précoce de développement, contrôler la taille des transcrits, et la présence d’impuretés comme le dsRNA permet d'éviter bien des anomalies lors des étapes ultérieures. (4,5)

Explorez nos ressources « Solutions de thérapie par ARNm »  la synthèse, purification et à la caractérisation de l'ARN à toutes les étapes du développement (5,10).

https://promega.widen.net/s/xjsgmjxkqp/mrna-therapy-solutions-infographic

SITE WEB : https://france.promega.com/applications/gene-therapy-tools/rna-therapy/mrna-therapy-solutions/#mrna-production-9624baae-c55a-46ef-86ed-7ea45f941506

References

1. Beckert, B., & Masquida, B. (2010). Synthesis of RNA by in vitro transcription. RNA, 703, 29–41. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-248-9_3
2. Garber, K. (2022). mRNA pioneers refocus on therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery, 21, 699–701. https://www-nature-com.ezprom01.infotrieve.com/articles/d41573-022-00156-5
3. In Vitro Transcription | RNA Synthesis Kits | RNA Production. (2026). Promega.com. https://www.promega.com/products/rna-analysis/in-vitro-transcription/
4. Lenk, R., Kleindienst, W., Szabó, G. T., Baiersdörfer, M., Boros, G., Keller, J. M., Mahiny, A. J., & Vlatkovic, I. (2024). Understanding the impact of in vitro transcription byproducts and contaminants. Frontiers in Molecular Biosciences, 11. https://doi.org/10.3389/fmolb.2024.1426129
5. mRNA Therapy Solutions. (2026). Promega.com. https://www.promega.com/applications/gene-therapy-tools/rna-therapy/mrna-therapy-solutions/
6. Patel, P. R. (2023). Chemistry, Manufacturing and Controls: Regulatory Considerations Through Clinical Development. https://www.fda.gov/media/175396/download
7. Promega Corporation. (2024, June). IVT RNA ProNex [Application note] (Publication No. PA1001; Version 06/24). https://promega.widen.net/s/hchgrkqvrm/ivt-rna-pronex-pa1001
8. Promega Corporation. (2024, October). Custom raw materials for mRNA synthesis [Flyer] (Publication No. FL682I). https://promega.widen.net/s/jvwcfpprrd/custom-raw-materials-for-mrna-synthesis-a4-fl682i-print
9. Promega Corporation. (2025, October). In vitro transcription [Flyer] (Publication No. GFN368). https://promega.widen.net/s/rpss2spqkz/ivtranscription_ltr_gfn368
10. Raw Materials for mRNA Therapeutic Manufacture. (2026). Promega.com. https://www.promega.com/custom-solutions/custom-manufacturing/mrna-manufacturing/