Injecter ou ne pas injecter ?

Les dosages des différentes luciférases sont des outils utiles pour étudier une large gamme de questions biologiques. Ils peuvent être réalisés facilement en ajoutant aux cellules ou à un lysat cellulaire un réactif qui fournit les composants nécessaires pour générer un signal luminescent directement. Cependant, une fois ce réactif ajouté, le temps d’attente pour mesurer le signal devient une considération importante pour obtenir des données cohérentes. Selon le type de luciférase que vous utilisez, vous pourriez avoir besoin d'un luminomètre capable d'utiliser des injecteurs pour délivrer ces réactifs.

 

Commençons par discuter de deux types de dosages luciférase : les dosages "flash" et les dosages "glow". Comme leurs noms l'indiquent, un dosage de type "flash" est un dosage où le signal est fort mais de courte durée. Les dosages de type "glow" prolongent le signal, de sorte que leur demi-vie est de l'ordre de plusieurs heures, pas de quelques minutes. Le compromis est que les dosages de type "glow" ont des intensités de signal plus faibles. Pour la plupart des applications, le compromis est avantageux.

 

Avec ces points à l'esprit, nous pouvons discuter de la gamme de produits avec les différentes luciférases chez Promega. La plupart de nos kits récents intègrent "GLO" dans leur nom car ils sont conçus comme des dosages de type "glow". Leur demi-vie de signal est longue et offre aux utilisateurs une grande flexibilité pour mesurer le signal et les injecteurs ne sont pas nécessaires. D'autres kits, tels que notre Luciferase Assay System, Renilla Luciferase Assay System et Dual-Luciferase® Assay System, sont basés sur la tehcnologie de type « flash ». Dans les dosages « flash », la demi-vie du signal de la luciférase Firefly est d'environ 10 minutes. Pour Renilla, elle est d'environ 2 minutes seulement. Pour ces kits, il est fortement recommandé d'utiliser un luminomètre avec des injecteurs.

 

Pourquoi ? Eh bien, en tenant compte de tout ce que nous avons discuté ci-dessus, imaginez une expérience où vous préparez une plaque de 96 puits remplie de lysat de cellules exprimant un ou les deux de ces marqueurs. Imaginons également que chacun de ces puits contienne exactement la même quantité d'un marqueur de luciférase. Et enfin, imaginons également que vous ayez utilisé une pipette multicanal à 8 puits pour ajouter le réactif du dosage à chaque colonne, un par un. Une fois que vous avez ajouté le réactif du dosage, le signal atteindra son maximum presque immédiatement et commencera à diminuer rapidement.

Après avoir ajouté tous les réactifs dans vos puits, vous placerez la plaque dans votre luminomètre. Pour nos dosages flash, nous suggérons un temps de lecture d'environ 10 secondes. 96 puits x 10 secondes = 960 secondes, soit 16 minutes ! Rappelez-vous que la demi-vie même d'un signal de luciférase Firefly dans un dosage flash est de 10 minutes. Cela signifie que vous vous attendriez à ce que le signal du puits A1 soit au moins deux fois plus élevé que le puits H12 à partir du même échantillon de départ. Pour la Renilla, cela serait encore pire car la demi-vie est d'environ 2 minutes.

 

Lorsque vous considérez tout cela, il devient très clair pourquoi vous ne voulez pas mesurer une expérience basée sur la technologie « flash » de cette manière. Donc, si vous devez utiliser un dosage de luciférase basé sur une mesure flash, il existe essentiellement deux bonnes options :

• Utilisez un luminomètre à tube et ajoutez votre réactif dans un seul tube à la fois, mesurez immédiatement, puis répétez avec les échantillons restants.

   

• Utilisez un luminomètre avec des injecteurs. La plupart peuvent être facilement programmés pour injecter le réactif spécifique, mesurer le signal, puis passer au puits suivant et répéter.

Heureusement, les dosages de type "glow" fonctionnent pour la plupart des applications, donc même si vous n'avez pas d'injecteurs, vous pouvez toujours facilement réaliser un dosage luminescent.