Quelles sont les méthodes couramment utilisées pour étudier la cytotoxicité cellulaire ?
Il existe deux méthodes couramment utilisées pour évaluer la mort des cellules.
Toutes deux se réfèrent à la perte d’intégrité membranaire et à la capacité de certaines molécules d’atteindre des compartiments cellulaires inaccessibles tant que la membrane cellulaire est intacte. Comme illustré dans le schéma ci-dessous, ces tests incluent la mesure du passage d’un composé du cytoplasme vers le milieu de culture, généralement des marqueurs enzymatiques, ou à l’inverse la pénétration dans le cytoplasme d’un colorant non perméant quand la membrane cellulaire est intacte.
Produits Promega:CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay (Cat.# G9290), CytoTox-Fluor™ Cytotoxicity Assay (Cat.# G9260)
Comment fonctionne le test de coloration au bleu trypan ?
L’examen microscopique d’un hématimètre après une coloration sélective des cellules mortes avec le bleu trypan est l’une des méthodes fréquemment utilisées en routine pour déterminer le nombre de cellules et le pourcentage de cellules viables d’une population cellulaire. Le principe repose sur la capacité du bleu trypan à ne pénétrer que dans les cellules dont la membrane plasmatique est endommagée.
Cette technique de comptage n’est applicable qu’avec un seul ou un petit nombre d’échantillons. Les principaux inconvénients de cette approche sont : les erreurs dues au fait que la mesure n’est réalisée que sur un seul échantillon, le jugement subjectif de l'utilisateur pour différentier une cellule morte d’un débris coloré, la variabilité entre opérateurs et enfin le temps et le travail nécessaire pour traiter plusieurs échantillons.
Comment fonctionnent les tests de cytotoxicité utilisant un composé fluorescent se fixant à l'ADN et comment le choisir ?
Les cellules viables sont en général non perméables aux composés fluorescents qui ont la propriété de se fixer à l’ADN. Ils peuvent donc être utilisés en format microplaque pour mesurer l’accumulation de cellules mortes. Les principaux critères à prendre en considération pour bien choisir un dye fluorescent sont : sa longueur d’excitation et d’émission, sa propriété à se fixer sur l’ADN de façon spécifique, sa perméabilité membranaire, sa solubilité à la concentration recommandée par le fournisseur, sa sensibilité et enfin sa toxicité cellulaire. Les composés fluorogéniques capables de traverser la membrane cellulaire intacte pour colorer le noyau des cellules viables ne peuvent donc pas être utilisés pour mesurer la cytotoxicité.
Produit Promega : CellTox™ Green Cytotoxicity Assay (Cat.# G8741)
Peut-on mesurer la cytotoxicité en temps réel ?
Oui car les composants se fixant sur l’ADN peuvent être utilisés pour mesurer la mort cellulaire au cours du temps. Cependant il est important d’étudier en amont les effets procurés d’une exposition prolongée à ce composant sur la viabilité de la cellule et la réponse obtenue. Les figures ci-dessous révèlent les effets de trois différents composants fluorescents, au cours d’une exposition de 72H, sur la viabilité de 4 types de lignées cellulaires. La viabilité des cellules est mesurée par ATPmétrie.
Comment fonctionne le dosage de la Lactate déshydrogénase ( LDH) ?
Les cellules mortes ayant perdu leur intégrité membranaire peuvent aussi être détectées par la mesure du passage de marqueurs du cytoplasme vers le milieu de culture. Le marqueur le plus couramment utilisé pour cette approche est la lactate déshydrogénase LDH, enzyme qui transforme le pyruvate en lactate en réduisant le NAD+ en NADH. Le NADH peut être alors utilisé pour réduire diverses molécules devenant ainsi colorées, fluorescentes ou encore luminescentes. La figure ci-dessous illustre le mécanisme d’action et la réaction chimique utilisée pour mesurer la LDH libérée dans le milieu de culture par les cellules mortes. Une quantité excessive de lactate et de NAD+ est ajoutée dans le milieu réactionnel pour que la LDH libérée produise du pyruvate et du NADH. Le pouvoir réducteur du NADH permet alors dans cet exemple de convertir la resazurine en resorufine qui est une molécule fluorescente.
Les versions colorimétriques de ce type d’essai utilisent un composé le tétrazolium comme substrat de diaphorase qui est converti en formazan, produit fortement coloré qui peut être mesuré à l'aide d'un spectrophotomètre.
De même la version bioluminescente utilise un pro-substrat de la luciferine qui est converti en luciferine active dont on mesure le signal lumineux à l’aide d’un luminomètre.
Le test colorimétrique développé il y a déjà plusieurs dizaines d’années présente l’inconvénient d’être peu sensible et peu pratique. En effet le tampon utilisé étant toxique pour les cellules vivantes, il est nécessaire de prélever le surnageant pour effectuer le test dans un autre puits.
Le test fluorescent est plus sensible et plus homogène que le test colorimétrique mais c’est la version bioluminescente qui est la plus sensible et la plus simple d’utilisation. Ce test peut ainsi être réalisé sur un faible volume de milieu de culture cellulaire, 2 à 5µl, offrant la possibilité de réaliser des cinétiques en multipliant les prélèvements à différents temps d’incubation.
Produits Promega: LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay (Cat.# J2380), CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay (Cat.# G7890)
Pour en savoir plus: Assay Guidance Manual
